Cas9的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株是什么？為什么要構(gòu)建它？

Cas9的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株是什么？為什么要構(gòu)建它？

一、什么是穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株？

是指在細胞中持續(xù)穩(wěn)定地表達特定的基因，或者妨礙特定的基因的表達。細胞株目的基因質(zhì)粒DNA整合到細胞染色體上，在細胞中長期穩(wěn)定表達。穩(wěn)定表達細胞株彌補了瞬時感染(或轉(zhuǎn)染)實驗中中外源基因表達時間短的缺陷，便于長期觀察。

二、什么時候需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株？

1、長期在目的細胞中研究基因功能；

2 、一些蛋白半衰期極長，瞬時RNA只能干擾表達，不能去除已經(jīng)表達的目標蛋白，希望實現(xiàn)更好的基因干擾效應(yīng)

3 、選取復制數(shù)量適量的細胞進行實驗研究，希望實驗更加準確

4 、誘導表達系統(tǒng)主要需要致死基因或時空表達

5 、需要用細胞做動物實驗的裸鼠腫瘤等。

三、CRISPR/Cas9基因敲除細胞株構(gòu)建

用經(jīng)典方法建立高產(chǎn)穩(wěn)定細胞株依賴外源基因?qū)λ拗骷毎蚪M的隨機整合，難以保證插入部位的表達水平和細胞株生長特性的穩(wěn)定。

CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)⒏信d趣的目標基因定點整合到染色體基因組的特定部位。通過靶基因序列的確定、sgRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、流式細胞術(shù)陽性篩選、克隆擴大、基因分析等一系列操作，成功構(gòu)建了穩(wěn)定的細胞株。